Apoptosis

MEKANISME DAN REGULASI APOPTOSIS

1. Pengertian apoptosis

Apoptosis berasal dari bahasa Greek , yang artinya gugurnya putik bunga ataupun daun dari batangnya. Pada tahun 1972 , Kerr J.F , Wyllie A.H , Currie A.R mempublikasikan artikel British Journal Of Cancer dengan judul : Apoptosis: a basic bioligical phenomen with wide ranging implication in tissue kinetic. Artikel ini menjelaskan tentang proses kematian normal pada sel yang disebut dengan apoptosis.

              Kematian sel yang terprogram atau apoptosis merupakan suatu komponen yang normal pada perkembangan dan pemeliharaan kesehatan pada organisme multiseluler. Sel yang mati ini merupakan respon terhadap berbagai stimulus dan selama apoptosis sel ini dikontrol dan diregulasi, sel yang mati kemudian difagosit oleh makrofag. Apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada nekrosis terjadi kematian sel tidak terkontrol .Sel yang mati pada nekrosis akan membesar dan kemudian hancur dan lisis pada satu daerah yang merupakan respon terhadap inflamasi. (Dr. Fitriani Lumongga : Apoptosis, 2008. Hal:2)

Terdapa dua kategori  utama kematian sel. Kategori pertama adalah kematian sel nekrotik, terjadi apabiala  suatu rangsangan yang menyebabkan cedera pada sel terlalu kuat atau berkepanjangan.  Nekrosis sel dicirikan dengan adanya pembengkakan dan ruptur organel internal yang kebanyakan mengenai mitokondria , dan jelasnya  stimulasi respon peradangan. Kategori kedua, kematian sel adalah apoptosis yaitu kematian sel yang diprogram.  Apoptosis adalah suatu yang ditandai dengan terjadinya urutan teratur tahap molekular yang menyebabkan disentegrasi sel. Apoptosis tidak ditandai dengan adanya pembengkakan atau peradangan , namun sel akan mati menyusut dengan sendirinya dan dimakan oleh sel disebelahnya. Apoptosis berperan dalam menjaga jumlah sel relatif konstan dan merupakan suatu mekanisme yang dapat mengeleminasi  sel yang tidak diinginkan, sel yang menua, sel berbahaya, atau sel pembawa transkripsi DNA yang salah. Apoptosis merupakan proses aktif yang melibatkan kerja sel itu sendiri, dan namanya diambil kata Yunani yabf berarti “menciut” seperti menguncupnya sebuah bunga. Berikut adalah penyebab kematian sel nekrotik dan apoptosis.

1. Penyebab Kematian Sel Nekrotik

Faktor yang sering menyebabkan kematian sel nekrotik adalah hipoksia berkepanjangan, infeksi yang menghasilkan toksin dan radikal bebas, kerusakan integritas membran sampai pada pecahnya sel. Respon imun dan peradangan terutama sering dirangsang oleh nekrosis yang menyebabkan cedera lebih lanjut dan kematian sel sekitar. Nekrosis sel dapat menyebar di seluruh tubuh tanpa menimbulkan kematian pada individu.

2. Penyebab Apoptosis

Kematian sel terprogram dimulai selama embriogenesis dan terus berlanjut sepanjang waktu hidup organisme. Rangsang yang menimbulkan apoptosis meliputi isyarat hormon, rangsangan anti gen, peptiada imun, dan sinyal membran yang mengidentifikasi sel yang menua atau bermutasi. Virus yang menginfeksi sel akan seringkali meyebabkan apoptosis, yang pada akhirnya mengakibatkan kematian virus dan sel pejamu (host). Hal ini merupakan satu cara yang dikembangkan oleh organisme hidup untuk melawan infeksi virus. Virus tertentu (mis ., virus EpsteinBarr yang bertanggungjawab terhadap mononukleosis) pada gilirannya menghasilkan protein khusus menginaktifkan respon aptosis. Definisi aptosis telah berpengaruh pada perkembangan kanker dan penyakit neuro degeneratif dengan penyebab yang tidak diketahui, termasuk penyakit Alzheimer dan sklerosis lateral amiotrofik  (penyakit Lou Gehrig). Apoptosis yang dirangsang- antigen dari sel imun (sel T dan B) sangat penting dalam menimbulkan dan mempertahankan toleransi diri imun. (J. Corwin, Elizabeth. Buku Saku Patofisiologi2009. Hal : 26-27)

              (Gambar 1). Contohnya adalah pada diferensiasi jari manusia selama perkembangan embrio membutuhkan sel-sel di antara jari-jari untuk apoptosis sehingga jari-jari dapat terpisah.

Gambar 1. Perbedaan apoptosis dan nekrosis

Sejak awal tahun 1990, penelitian mengenai apoptosis berkembang dengan pesat. Penelitian mengenai apoptosis dimulai dengan studi pada Caenorhabditis elegans. Cacing dewasa memiliki 1000 sel, di mana selama perkembangannya ada 131 sel yang mati. Ada 2 bentuk mutasi ditemukan yaitu ced 3 dan ced 4. Sekuen ced 3 homolog dengan Interleukin Converting Enzyme (ICE) yang dibutuhkan untuk aktivasi proteolitik dari prekursor interleukin 1, di mana selama aktivasi ada hormon tertentu yang dilepaskan oleh sel imun tertentu yang dapat memacu terjadinya inflamasi. Hal ini menunjukkan bahwa proteolisis dibutuhkan untuk apoptosis.

Apoptosis pertama kali di temukan dalam embrio yang sedang berkembang, saat kematian sel terprogram menjadi proses yang penting bagi pembentukan embrio (morfogenesis). Peneliti kemudian melihat bahwa apoptosisi juga merupakan peristiwa yang umum di jumpai dalam jaringan orang dewasa normal.(junqueira carneiro,histologi dasar.hal : 62)

2. Peranan apoptosis

Apoptosis memiliki peranan penting dalam fenomena biologis, proses apoptosis yang tidak sempurna dapat menyebabkan timbulnya penyakit yang sangat bervariasi. Terlalu banyak apoptosis menyebabkan sel mengalami kekacauan, sebagaimana terlalu sedikit apoptosis juga menyebabkan proliferasi sel yang tidak terkontrol (kanker). Beberapa contoh penyakit yang ditimbulkan karena apoptosis yang tidak sempurna antara lain:

a.      Penyakit autoimun disebabkan karena sel T/B yang autoreaktif terus menerus.

b.      Neurodegeneration, seperti pada penyakit Alzheimer dan Parkinson, akibat dari apoptosis prematur yang berlebihan pada neuron di otak. Neuron yang tersisa tidak mempunyai kemampuan untuk meregenerasi sel yang hilang.

c.      Stroke iskemik, aliran darah ke bagian-bagian tertentu dari otak dibatasi sehingga dapat menyebabkan kematian sel saraf melalui peningkatan apoptosis.

d.      Kanker, sel tumor kehilangan kemampuannya untuk melaksanakan apoptosis sehingga proliferasi sel meningkat. (CCRC Farmasi UGM File, Regulasi apoptosis.Hal:3)

3. Fungsi Apoptosis

            Kematian sel melalui apoptosis merupakan fenomena yang normal, yaitu terjadi eliminasi sel yang tidak diperlukan lagi. Proses apoptosis secara fisiologis diperlukan untuk :

            1. Terminasi sel

            Apoptosis dapat terjadi pada sel yang mengalami kerusakan yang tidak bisa di repair,infeksi virus, keadaan yang mengakibatkan stress pada sel . Kerusakan DNA akibat ionisasi radiasi maupun bahan kimia toxic juga dapat mencetuskan apoptosis melalui aktivasi tumor supresor gen p53.  Keputusan untuk apoptosis dapat berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan disekitarnya ataupun dari sel yang termasuk dalam immune system. Pada keadaan ini fungsi apoptosis adalah untuk mengangkat sel yang rusak, mencegah sel menjadi lemah oleh karena kurangnya nutrisi dan mencegah penyebaran infeksi virus.

            2. Mempertahankan homeostasis

            Pada organisme dewasa, jumlah sel dalam suatu organ atau jaringan harus berada dalam keadaan yang relatif konstan. Proses keseimbangan ini termasuk dalam homeostasis yang dibutuhkan oleh makhluk hidup untuk mempertahankan lingkungan internalnya.

            Keseimbangan (homeostasis) ini dapat tercapai bila kecepatan mitosis pada jaringan seimbang dengan kematian sel. Bila keseimbangan ini terganggu, maka akan dapat mengakibatkan :

v  Bila kecepatan pembelahan sel lebih tinggi daripada kecepatan kematian sel → terbentuk tumor

v  Bila kecepatan pembelahan sel lebih rendah dari kecepatan kematian sel → jumlah sel menjadi berkurang.

            3. Perkembangan embryonal

            Kematian sel yang terprogram merupakan bagian dari perkembangan jaringan. Pada masa embryo , perkembangan suatu jaringan atau organ didahului oleh pembelahan sel dan diferensiasi sel yang besar-besaran dan kemudian dikoreksi melalui apoptosis.

            Contoh: bila terjadi gangguan proses apoptosis, berupa diferensiasi inkomplit pada pembelahan jari-jari akan mengakibatkan syndactyly.

            4. Interaksi limfosit

            Perkembangan limfosit B dan Limfosit T pada tubuh manusia merupakan suatu proses yang kompleks , yang akan membuang sel-sel yang berpotensi menjadi rusak. Cytotoksik T sel dapat secara langsung menginduksi apoptosis pada sel melalui terbukanya suatu celah pada target membran dan pelepasan zat-zat kimia untuk mengawali proses apoptosis. Celah ini dapat terjadi melalui adanya sekresi perforin, granul yang berisi granzyme B, serine protease yang dapat mengaktivasi caspase melalui pemecahan residu aspartat.

            5. Involusi hormonal pada usia dewasa.

            Apoptosis dapat terjadi misalnya pada pelepasan sel endometrium selama siklus menstruasi, regresi pada payudara setelah masa menyusui dan atresia folikel ovarium pada menopause. (Dr. Fitriani Lumongga : Apoptosis, 2008. Hal:2)

4. Mekanisme apoptosis

Mekanisme apoptosis sangat kompleks dan rumit. Secara garis besarnya apoptosis dibagi menjadi 4 tahap, yaitu :

1.    Adanya signal kematian (penginduksi apoptosis).

2.    Tahap integrasi atau pengaturan (transduksi signal, induksi gen apoptosis yang berhubungan, dll)

3.    Tahap pelaksanaan apoptosis (degradasi DNA, pembongkaran sel, dll)

4.    Fagositosis.

1. Signal Penginduksi Apoptosis

Apoptosis tidak memerlukan suatu proses transkripsi atau translasi. Molecular machine yang dibutuhkan untuk kematian sel dianggap mengalami dormansi dan hanya memerlukan aktivasi yang cepat. Signal yang menginduksi apoptosis bisa berasal dari ekstraseluler dan intraseluler.

Signal ekstraseluler contohnya hormon hormon. Hormon tiroksin menginduksi apoptosis pada ekor tadpole. Apoptosis juga bisa dipicu oleh kurangnya signal yang dibutuhkan sel untuk bertahan hidup seperti growth factor. Sel lain, sel berhubungan dengan sel yang berdekatan juga bisa memberikan signal untuk apoptosis.

Signal intraseluler misalnya radiasi ionisasi, kerusakan karena oksidasi radikal bebas, dan gangguan pada siklus sel.

Kedua jalur penginduksi tersebut bertemu di dalam sel, berubah menjadi famili protein pengeksekusi utama yang dikenal sebagai caspase. Sel yang berbeda memberikan respon yang berbeda terhadap penginduksi apoptosis. Misalnya sel splenic limfosit akan mengalami apoptosis saat terpapar radiasi ionisasi, sedangkan sel myocyte tidak mengalami apoptosis untuk pemaparan yang sama.

Pada manusia dan mamalia lain, beberapa jalur berbeda, yang melibatkan 15 kaspase berbeda,dapat melaksanakan apoptosis. Jalur yang di gunakan bergantung pada tipe sel dan sinya yng memicu apoptosis slah satu jalur utamanya melibatkan protein mitokondria. Protein-protein apoptosis dapat membentuk pori-pori molekuler di membran luar mitokondria, menyebabkan membran tersebut bocor dan melepaskan protein ynag mendorong terjadinya apoptosis.

Pada titik-titik kunci dalam program apoptosis, protein mengintegrasi sinyal-sinyal dari beberapa sumber yang berbeda dan dapat mngirim suatu sel menuruni jalur berbeda dan dapat mengirim suatu sel menuruni jalur apoptosis. Sinyal seringkali berasal dari luar sel, seperti molekul sinyal kematian seperti pada gambar berikut. ( Neil campball.2008.biologi jilid 1 edisi 8.hal :240)

2. Regulator Molekuler dari Apoptosis

Signal kematian dihubungkan dengan pelaksanaan apoptosis oleh tahap integrasi atau pengaturan. Pada tahap ini terdapat molekul regulator positif atau negatif yang dapat menghambat, memacu, mencegah apoptosis sehingga menentukan apakah sel tetap hidup atau mengalami apoptosis (mati).

Apoptosis diperantarai oleh famili protease yang disebut caspase, yang diaktifkan melalui proteolisis dari bentuk prekursor inaktifnya (zymogen). Caspase merupakan endoprotease yang memiliki sisi aktif Cys (C) dan membelah pada terminal C pada residu Asp, oleh karena itu dikenal sebagai Caspases (Cys containing Asp specific protease).

Saat ini telah ditemukan 13 anggota famili caspases pada manusia. Beberapa anggota famili caspase yang terlibat dalam apoptosis dibedakan menjadi 2 golongan. Golongan yang pertama terdiri dari caspase 8, 9,10 yang mengandung prodomain yang panjang pada terminal N, fungsinya sebagai inisiator dalam proses kematian sel. Golongan yang kedua terdiri dari caspase 3, 6, 7 yang mengandung prodomain yang pendek dan berfungsi sebagai efektor, membelah berbagai substrat yang mati yang pada akhirnya menyebabkan perubahan morfologi dan biokimia yang tampak pada sel yang mengalami apoptosis. Molekul efektor lain dalam apoptosis adalah Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) bersama sitokrom c mengambil pro-caspase 9 di ATP-dependent manner, dan menstimulasi proses perubahan pro-caspase 9 menjadi caspase 9.

Regulator apoptosis yang lain adalah anggota famili Bcl-2. Saat ini ada 18 anggota famili Bcl-2 yang telah diidentifikasi, dan dibagi ke dalam 3 grup berdasarkan strukturnya. Anggota grup pertama diwakili oleh Bcl-2 dan Bcl-xL yang berfungsi sebagai anti-apoptosis. Anggota grup kedua diwakili oleh Bax dan Bak (Bcl-2 associated killer), sebagaimana anggota grup yang ketiga yaitu Bid (a novel BH3 domain-only death agonist) dan Bad (the Bcl-2 associated death molecule), merupakan molekul pro-apoptosis (Gambar 2).

Gambar 2. Anggota famili bcl-2

ICE (Interleukin Converting Enzim) secara normal tidak terlibat dalam apoptosis, tetapi aktivasi tiruannya dalam sel mamalia, dapat mendorong ke arah tersebut. Masing-masing caspase mempunyai urutan yang sama, dirancang untuk membelah, maka menjadi jelas caspase membelah satu sama lain dalam suatu jalur mekanisme pengaktifan.

Dua rangkaian caspase saling melibatkan. Yang satunya menginisiasi proses aktivasi caspase lainnya. Pertanyaannya siapa yang mengaktifkan caspase yang pertama? Tampak meragukan, sampai peneliti menemukan bahwa caspase dapat diaktifkan jika mereka mengumpul pada konsentrasi kritik. Ini bisa terjadi oleh ikatan molekul signal bunuh diri di permukaan sel. Perubahan konformasi reseptor dapat mendorong ke arah agregasi dari molekul reseptor permukaan dengan serentak dengan agregasi caspases intraseluler reseptor agregasi.

Target Caspase

Apoptosis melibatkan:

1.    memadatkan inti sel

2.    memadatkan dan membagi-bagi sitoplasma ke dalam selaput ikat badan apoptotis

3.    rusaknya kromosom ke dalam fragmen yang berisi berbagai nukleosom

Target protein pada umumnya harus protein lain, suatu DNA endonuklease. Ketika protein target pecah, DNase bebas untuk berpindah tempat ke inti dan mulai pelaksanaan. Perubahan dalam apoptosis terjadi ketika caspase 3 membelah gelsolin, suatu protein dilibatkan dalam pemeliharaan morfologi sel. Gelsolin yang dibelah membelah actin filamen di dalam sel. Protein yang lain diperlukan untuk membentuk badan apopotic: suatu kinase yang disebut p21-activated kinase 2 (PAK-2). Kinase ini diaktifkan oleh caspase-3 dengan proteolisis terbatas.

Tahap Pelaksanaan Apoptosis

Sinyal apoptosis bisa terjadi secara intraseluler dan ekstraseluler. Jalur ekstrinsik (ekstraseluler) diinisiasi melalui stimulasi dari reseptor kematian (death receptor) sedangkan jalur intrinsik diinisiasi melalui pelepasan faktor signal dari mitokondria dalam sel.

Peristiwa apoptosis jalur ekstrinsik dimulai dari adanya pelepasan molekul signal yang disebut ligan oleh sel lain tetapi bukan berasal dari sel yang akan mengalami apoptosis. Ligan tersebut berikatan dengan death receptor yang terletak pada transmembran sel target yang menginduksi apoptosis. Death receptor yang terletak di permukaan sel adalah famili reseptor TNF (Tumor Necrosis Factor), yang meliputi TNF-R1, CD 95 (Fas), dan TNF-Related Apoptosis Inducing Ligan (TRAIL)-R1 dan R2.

Ligan yang berikatan dengan reseptor tersebut akan mengakibatkan caspase inisiator 8 setelah membentuk trimer dengan adaptor FADD (Fas Associeted Death Domain). Kompleks yang terbentuk antara ligan-reseptor dan FADD disebut DISC (Death Inducing Signaling Complex). CD 95, TRAIL-R1 dan R2 terikat dengan FADD, sedangkan TNF-R1 terikat secara tidak langsung melalui molekul adaptor lain, yaitu : TNF-Reseptor Associeted Death Domain protein (TRADD).

Stress mitokondria yang menginduksi apoptosis jalur intrinsik disebabkan oleh senyawa kimia atau kehilangan faktor pertumbuhan, sehingga menyebabkan gangguan pada mitokondria dan terjadi pelepasan sitokrom c dari intermembran mitokondria. Protein capcase-8 akan memotong anggota famili Bcl-2 yaitu Bid. Kemudian Bid yang terpotong pada bagian ujungnya akan menginduksi insersi Bax dalam membran mitokondria dan melepaskan molekul proapoptotik seperti sitokrom c, Samc/Diablo, Apoptosis Inducing Factor (AIF), dan omi/Htr2. dengan adanya dATP akan terbentuk kompleks antara sitokrom c, APAF1 dan caspase 9 yang disebut apoptosom. Selanjutnya, capcase 9 akan mengaktifkan downstream procaspase-3.

Protein caspase 3 yang aktif memecah berbagai macam substrat, diantaranya enzim DNA repair seperti poly-ADP Ribose Polymerase (PARP) dan DNA protein kinase yaitu protein struktural seluler dan nukleus, termasuk aparatus mitotik inti, lamina nukleus, dan aktin serta endonuklease, seperti Caspase-Aktivated Deoxyribonuklease Inhibitor (ICAD) dan konstituen seluler lainnya. Selain itu, caspase 3 juga mempunyai kemampuan untuk mengaktifkan caspese lainnya, seperti procaspase-6 dan procaspase-7 yang memberikan amplifikasi terhadap kerusakan seluler.

Adanya seluler stres meningkatkan ekspresi dari protein p53 yang mengakibatkan terjadinya GI arrest atau apoptosis. Anggota dari apoptosis Stimulating Protein p53 (ASPP) yaitu ASPP 1 dan ASPP 2 secara spesifik menstimulasi fungsi transsktivasi p53 pada promotor gen proapoptotik seperti Bax dan p53 Inducible Gene 3 (PIG 3), tapi tidak pada promotor gen yang menyebabkan cell cycle arrest, yaitu p21 dan MDM2.

a.    Tahapan apoptosis jalur ekstrinsik/deatch receptor pathway

Jalur ini khas pada sistem imun dan digunakan untuk menghilangkan sel T yang aktif pada akhir dari respon imun. Jalur ini terutama diperantarai oleh perforin / granzyme. Tahap-tahap apoptosis dalam death receptor pathway :

i. Ikatan antara FasL, suatu TNF (Tumor Necrosis Factor) dengan reseptornya.

TNF adalah molekul penginduksi interseluler yang berupa asam amino-157, dihasilkan terutama oleh makrofag yang teraktivasi, merupakan mediator apoptosis ekstrinsik utama. Ada 2 macam reseptor untuk TNF yaitu TNFR-1 dan TNFR-2. TNF yang berikatan dengan TNFR-1 yang dapat menginisiasi jalur aktivasi caspase. Fas (Apo-1 atau CD 95) adalah reseptor untuk signal apoptosis ekstrinsik lain pada membran sel, dan termasuk famili reseptor TNF. FasL (Fas ligan) adalah protein yang berikatan dengan Fas untuk mengaktifkan jalur Fas. Fas merupakan protein transmembran yang juga termasuk famili TNF.

ii. Ikatan FasL dengan Fas menginduksi reseptor untuk mengelompok (trimerisasi)

Gambar Ikatan FasL dengan Fas menyebabkan trimerisasi reseptor

iii. Pengikatan FADD (Fas associated death domain protein) pada domain kematian (death domain).

iv. DED (death effector domain) dari FADD mengikat pro-caspase 8. Kompleks yang terbentuk disebut DISC (death-inducing signaling complex), kompleks ini mengaktivasi pro-caspase 8.

v. Caspase 8 yang teraktivasi (heterotetramer) dilepaskan dari DISC ke sitoplasma. Caspase 8 termasuk caspase inisiator yang akan mengaktivasi caspase eksekutor terutama melalui pro-caspase 3

b.    Tahapan apoptosis jalur ekstrinsik / Mitocondrial Pathway

Riset mengindikasi keterlibatan mitokondria dalam jalur apoptotis. Sitokrom c, suatu heme protein yang bertindak sebagai suatu pembawa elektron dalam fosforilasi oksidasi mitokondria, pemberhenti elektron cytochrome C oxidase atau kompleks IV, keluar intermembran dan mengikat protein sitoplasmik yang disebut Apaf-1. Yang kemudian mengaktikan suatu inisiator caspase-9 di sitoplasma.

Protein ini keluar mitokondria setelah perubahan potensiasi eletrokimia di membran. Perubahan potensial menyebabkan terbukanya suatu kanal yang non-spesifik dalam membran yang permeabel, terdiri atas dua protein selaput bagian dalam (adenine nucleotide translocator-ANT) dan suatu protein bagian luar (porin, yang voltage-gated-kanal anion VDAC). Protein ini bertindak bersama-sama, kemungkinan pada sisi luar dan sisi dalam terjadi kontak. Saluran ini dapat dilewati zat yang memiliki bobot molekular kurang dari 1500. Perubahan gradien proton menyebabkan oksidasi dan foforilasi di mitokondria perubahan kekuatan ion menyebabkan pembekakan matriks. Karena sisi bagian dalam sangat kusut dan memilki luas permukaan jauh lebih besar dibanding selaput yang luar, bengkak pada matriks mengarah rusaknya sisi luar, sehingga sitokrom c dan Apaf-1 keluar masuk sitoplasma.

Jalur ini biasa diaktifkan dalam respon stimulus letal yang lain seperti pengrusakan DNA, stress oksidatif, dan hipoksia. Mitokondria mengandung faktor pro-apoptosis seperti sitokrom c dan AIF (apoptosis inducing factors). Keduanya merupakan substrat yang berbahaya, akan tetapi tersimpan aman dalam mitokondria. Saat keduanya dilepaskan ke sitoplasma dapat mengaktifkan jalur aktivasi caspase. Pelepasannya diatur oleh famili Bcl-2 yang terikat dengan mitokondria, yaitu Bax dan Bad.

Sitokrom c dalah protein heme yang berperan sebagai pembawa elektron yang larut dalam air dalam fosforilasi oksidatif mitokondria. Bila terjadi kumparan elektron melalui sitokrom c oxidase atau kompleks IV, adanya perubahan kekuatan ion menyebabkan gelombang matriks. Saat membran dalam mitokondria memiliki permukaan yang lebih luas dibanding membran luar maka gelombang matriks menyebabkan nonspecific inner membrane permeability transition pore terbuka sehingga sitokrom c keluar ke sitoplasma. Sitokrom c yang keluar ke sitoplasma kemudian berikatan dengan Apaf-1 membentuk CARD (Caspase Recruitment domain). Beberapa CARD bergabung membentuk kompleks apoptosome kemudian mengikat pro-caspase 9 dan mengaktivasinya menjadi caspase 9 (caspase inisiator). Caspase 9 ini akan mengaktivasi procaspase-3 menjadi caspase 3 yang merupakan caspase efektor yang melaksanakan apoptosis.

Caspase memecah protein menyebabkan inti sel pecah. Protein yang merupakan target caspase biasanya terikat dengan protein lain, yaitu sebuah DNA endonuklease. Saat protein pecah, DNase bebas bermigrasi ke nukleus dan memecahnya. Perubahan membran terjadi saat caspase 3 memecah gelsolin, suatu protein yang terlibat dalam pemeliharaan morfologi sel. Gelsolin yang terpecah akan membelah filamen aktin di dalam sel. Caspase 3 juga mengaktivasi kinase yang disebut p21-activated kinase 2 (PAK 2) melalui proteolisis. PAK2 termasuk protein yang dibutuhkan dalam membentuk apoptotic body.

Selama apoptosis mitokondria mengalami perubahan yang disebabkan oleh :

a.    Gangguan oksidasi-fosforilasi dan transport elektron karena radiasi dan adanya second messenger tertentu seperti ceramide.

b.    Perubahan dalam potensial redoks sel dan turunan Reactive Oxygen Species (ROS).

c.    Kerusakan DNA.

d.    Kerusakan DNA memacu ekspresi protein yang dikenal sebagai p53. protein ini menyebabkan penghambatan pembelahan sel atau apoptosis, dimana keduanya akan mnjaga sel dari menjadi sel tumor. Oleh karena itu gen p53 adalah gen tumor suppressor.

e.    Peningkatan ion Ca²⁺ intraseluler melalui tranduksi signal.

Death Receptor Pathway dan Mitocondrial Pathway bertemu saat caspase inisiator (caspase 8, 9, 10) menghasilkan aktivasi caspase efektor (caspase 3, 6, 7).

Gambar Pertemuan Death ReceptorPathway dan Mitocondrial Pathway

c.    Tahap Fagositosis

Sel yang terfragmentasi menjadi apoptotic body mengeluarkan signal “eat me” yang dikenali oleh fagosit. Ada 2 macam fagosit, yaitu :

•      Fagosit professional, contohnya sel makrofag.

•      Fagosit semiprofesional, sel tetangga dari sel yang mengalani apoptosis. Adanya sel-sel fagosit ini dapat menjamin tidak timbulnya respon inflamasi setelah terjadinya apoptosis.

Sel fagosit juga harus dihilangkan setelah aktif bekerja. Sel imun aktif mulai mengekspresikan Fas beberapa hari setelah aktivasi, mentargetkannya untuk eliminasi. Beberapa sel yang stress dapat mengekspresikan Fas dan FasL lalu digunakan untuk bunuh diri. Akan tetapi sebagian besar hanya dapat mengekspresikan Fas, sedangkan FasL diekspresikan terutama oleh sel T aktif.

Gambar 3. Transduksi signal apoptosis secara garis besar

Penginduksi apoptosis dikategorikan dalam 3 grup, yaitu faktor kematian, obat anti-kanker yang genotoksik, factor deprivation. Fas ligan, salah satu contoh faktor kematian, berikatan dengan reseptor Fas, menyebabkan trimerisasi. Domain kematian yang mengalami trimerisasi dalam sitoplasma mengikat pro-caspase 8 melalui FADD/MORT1 membentuk DISC. Pro-caspase 8 mengalami autoaktivasi pada DISC menjadi bentuk enzim yang aktif. Ada 2 jalur aktivasi caspase 3 melalui caspase 8 :

1)   Caspase 8 secara langsung mengubah pro-caspase 3 menjadi caspase 3. Caspase 3 membelah berbagai protein sel termasuk ICAD sehingga CAD dilepaskan dari ICAD, lalu mendegradasi kromosom DNA.

2)   Caspase 8 membelah Bid, molekul pro-apoptosis yang termasuk famili Bcl-2, yang kemudian ditranslokasikan ke mitokondria untuk melepaskan sitokrom c ke sitosol. Bcl-2 atau Bcl-xl, molekul anti-apoptosis, dapat menghambat pelepasan sitokrom c dengan mekanisme yang belum diketahui dengan pasti. Sitokrom c bersama Apaf-1 mengaktifkan Caspase 9, dimana caspase 9 kemudian mengaktifkan caspase 3. Caspase 3 membelah berbagai protein sel termasuk ICAD sehingga CAD dilepaskan dari ICAD lalu mendegradasi kromosom DNA.

Obat anti-kanker yang genotoksik seperti etoposida dan radiasi γ menyebabkan kerusakan kromosom DNA. Signal tersebut ditransfer ke mitokondria oleh p53 melalui mekanisme yang belum diketahui. Hal ini dapat menyebabkan pelepasan sitokrom c dari mitokondria dan mengaktifkan caspase 9 seperti dijelaskan di atas.

Apoptosis yang diinduksi oleh factor deprivation dapat dipelajari dengan baik menggunakan IL-3 dependent myeloid cell lines. Dengan keberadaan IL-3, signal dari reseptor IL-3 menyebabkan fosforilasi Bad, molekul pro-apoptosis famili Bcl-2. Bad yang terfosforilasi tertangkap oleh adaptor 14-3-3. Bila IL-3 sudah tidak ada lagi maka Bad yang tak terfosforilasi dilepaskan dari 14-3-3, lalu ditranslokasikan ke mitokondria untuk melepaskan sitokrom c untuk mengaktifkan caspase 9.

5. Pengendalian Apoptosis

Haruslah jelas sel menjaga kontrol caspases. Dua spesies untuk menginhibisi apoptosis adalah protein mitochondrial Bcl-2 dan Bcl-xL, yang dapat menghalangi pelepasan sitokrom c dari mitokondria. Protein keluarga Bcl mempunyai suatu gugus hidrofob dan terikat di sisi luar permukaan mitokondria dan organel lain seperti inti dan retikulum endoplasma. Protein ini mampu membentuk kanal ion di liposom.

Sejauh ini 15 anggota keluarga ini (ced-9 yang dihubungkan dengan C. elegans) telah ditemukan di manusia. Bcl-2 dapat juga mengikat Apaf-1 dan menghalangi pengaktifan inisiasi caspase 9. Bcl-2 diatur oleh perubahan ekspresi gen Bcl-2, dengan post-translational fosforilasi oleh kinase, atau oleh pecahnya caspase. Kelebihan ekpresi Bcl-2 dapat menyebabkan suatu sel menjadi suatu sel tumor. Anggota lain keluarga, BAX dan BAD yang mengikat mitokondria dan memfasilitasi apoptosis dengan menstimulasi pelepasan sitokrom C. Sebagai tambahan, protein lain yang disebut IAPS (inhibitor of apoptosis) dapat menghalangi caspase atau protein apoptotis lainnya.

Tabel 1. Beberapa molekul regulator yang berperan dalam apoptosis :

worker	Synonym	apoptosis			chromosome
			job
		pro		anti
Apaf-1	CED4	+			?
API3	Xiap			+	Xq25
	HILP
Bak1	Bcl-2L7	+			6p21
Bax		+			19q13
Bcl-2				+	18q21
Bid		+		+	22q11
Bik	NBK	+			?
Casp 2	ICH1	+			7q35
	NEDD2
Casp 3	CPP32B	+			4q33
	Yama
	CPP32
	apopain
Casp 4	TX	+			11q22
	ICH-2
	ICE-rel-II
Casp 6	MCH2	+			4q25
Casp 7	MCH3	+			10q25
	ICE-LAP3
	CMH-1

Casp 8	MACH	+		2q33
	MCH5
	FLICE
Casp 9	APAF3	+		?
	MCH6
	ICE-LAP6
Casp 10	MCH4	+		2q33
DAP-3		+		1q21
DFFB		+		?
FADD	MORT-1	+		11q13
Fas	APT1	+		10q24
	CD95
	Apo-1
	Fas1
	TNFRSF6
granzyme B	GZMB	+		14q11
	CTLA1
	CSPB
	CCPB1
	CGL-1
	CSP-B
NOL3			+	?
Parp		+		1q42
UBL1	PIC1		+	2q32
	GMP1
	SMT3C
	SUMO-1
	SMT3H3
	sentrin

6. Mengenali sel yang apoptosis

Sel yang mengalami apoptosis dapat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya maupun mikroskop elektron melalui ciri-ciri morfologis yang ditampakkan. Ciri-ciri tersebut antara lain :

a.    Sel menjadi bulat (sirkuler). Ini terjadi karena struktur protein yang menyusun sitoskeleton dicerna oleh enzim peptidase spesifik yang disebut caspaspse yang telah diaktifkan di dalam sel.

b.    Kromatin (DNA dan protein-protein yang terbungkus di dalam inti sel) mulai mengalami degradasi dan kondensasi.

c.    Kromatin mengalami kondensasi lebih lanjut, menjadi semakin memadat. Pada tahap ini, membran yang mengelilingi inti sel masih tampak utuh, walaupun caspase tertentu telah melakukan degradasi protein pori inti sel dan mulai mendegradasi lamin yang terletak dalam lingkungan inti sel.

d.    Lingkungan dalam inti sel tampak terputus dan DNA di dalamnya terfragmentasi (proses ini dikenal dengan karyorrhexis). Inti sel pecah melepaskan berbagai bentuk kromatin atau unit nukleosom karena disebabkan degradasi DNA.

e.    Plasma membran mengalami blebbing.

f.     Sel tersebut kemudian di’makan’ atau pecah menjadi gelembung-gelembung yang disebut apoptotic bodies dan kemudian di’makan’.

Sel yang mengalami apoptosis juga dapat dikenali dengan :

a.      Penandaan inti yang mengalami kondensasi dengan pewarna fluorescence Hoechst atau DAPI.

b.      Sel yang mengalami apoptosis mengeluarkan PS (Phosphatidil Serin) pada permukaan ekstraselulernya, sehingga dapat ditandai dengan annexin V yang dilabeli fluorescence. PS secara normal terdapat pada cytosolic surface dari membran plasma (di bagian dalam membran plasma), tetapi diredistribusikan ke permukaan ekstraseluler selama apoptosis oleh protein hipotetik yang dikenal sebagai scramblase.

c.      DNA yang terfagmentasi dapat dideteksi dengan TUNEL (Terminal deoxynuclotidyltransferase-mediated UTP end labelling) atau elektroforesis DNA yang diisolasi dalam gel agarosa. TUNEL juga dapat digunakan untuk mendeteksi enzim yang terlibat dalam pengrusakan i